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我国中药质量控制模式十年来的实践与探索
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发布时间:2023-02-07 14:19:37

从宋·辛弃疾的“云母屏开,珍珠帘闭,防风吹散沉香”到清·蒲松龄的“冬虫夏草名符实,变化生成一气通”,中医药孕育滋生于中华民族的历史长河,秉承着朴素的民族精神,与中华民族深厚的文化底蕴、人文智慧一脉相承。从古至今中医药在人类疾病防治中发挥了重大作用,是中华民族的宝贵财富。在2019年暴发的新冠肺炎疫情中,中医药更是运用其辨证施治理论,在疫情防控中发挥了不可替代的重大作用。在2022年世界卫生组织发布的《世界卫生组织中医药救治新冠肺炎专家评估会报告》充分肯定了中医药抗击新冠疫情的重要贡献。这是中医药的又一次重大实践,更是中医药智慧的体现。同时,近些年来国家对中医药发展的重视程度不断增加,为引导和支持中医药产业的发展,相关部门针对中药产业出台一系列政策,如《中医药发展战略规划纲要(2016~2030)》于2016年发布,《中华人民共和国中医药法》于2017年正式实施,在2019年和2021年中共中央分别印发了《中共中央国务院关于促进中医药传承创新发展的意见》和《关于加快中医药特色发展若干政策措施》。2022年发布的“十四五中医药发展规划”突出了提升中药质控水平是中药研究的主要任务之一。党的二十大大会报告再一次提到了“促进中医药传承创新发展”。由此可见,近年来振兴中医药事业战略已逐步实施,中医药产业迎来了发展的黄金时期。
中医药高质量发展的关键核心是建立科学合理的中药质量评价体系和高质量的评价标准,只有不断创新和完善中药质量评价模式,才能实现对中医药产业的正向引导,保证中药使用的安全有效。随着分析技术和仪器检测水平的不断提高,近些年来中药质量控制体系已经得到了充分的发展,尤其体现为中药质量标准的完善和质量评价理念的革新。但由于中药成分多样、作用机制复杂,如何采用现代技术有效、合理地去体现中药整体的、辨证的,特异性的理念;同时又兼备药品质控技术应具备的可操作、稳定、准确的特征,一直是制约着中药质控体系发展的瓶颈问题。
笔者从事中药质量监管与检验事业三十载,秉承为中药质控体系创新建言献策的宗旨,在本综述中对中药质量标准现有体系及尚存在的问题进行剖析,并梳理了近十年来中药质控领域形成的较为系统的新模式方法,展望了科学技术高速发展的未来中药领域应重点关注的方向,以期为中药质量评价拓宽思路,为促进中药高质量发展贡献力量。
1中药质量控制现有模式
随着分析技术的不断发展,中药的质量评价方式逐步从传统鉴别模式(性状、显微)发展为可准确量化的指标成分分析。现有的中药质量控制模式多采用传统经验鉴别与化学成分分析相结合的方式。所谓传统的经验鉴别即通过对中药的外观性状、颜色、气味等形态特征进行初步评价。而自20世纪70年代,随着光谱、色谱技术的不断普及,中药质控模式逐步借鉴化学药、天然药物的质控方法,即对其中的相关成分采用光谱、色谱技术进行测定。这种质控模式一直延续至今,尤其体现在现有的中药质量标准中。以《中国药典》中药材的质控标准为例,质控项目主要包括:名称、来源、性状、鉴别、检查、含量测定等,其中鉴别(如薄层鉴别)及含量测定项多采用光谱或色谱的方法对其中的指标性成分进行定性或定量分析。中成药是中药材的终产品,除了覆盖药材一般检验项目外,还要增加涉及其药品剂型相应的质控项目。综上所述,从现有标准质控的项目来看,药典标准以保证中药产品的安全性、真实性、有效性和稳定可控为主要目标。
从检测技术来看,近些年来新技术、新方法在中药质量控制中的应用显著增加,2000年前颁布的《中国药典》主要以传统性状、显微鉴别为主结合薄层色谱法以实现对药材的真伪鉴别;自《中国药典》2000年版以来,色谱法尤其是高效液相色谱法(HPLC)广泛地应用于中药(药材、提取物及中成药)中指标成分的定性及定量分析。据统计,《中国药典》1995年版仅在化橘红等5个品种项下采用HPLC进行含量测定,到2000年版增加到105个品种,到2005年版更是在518个中药品种项下都采用了HPLC法进行分析。HPLC快速易操作、方法准确稳定、耐用性佳等特点使其成为中药质控的首选方法。
2中药现有质控模式尚存在的问题分析
总的来说,近些年来中药质控体系在不断的完善与进步。从有效、稳定可控方面,标准收录各品种的指标性成分测定项目数量大大增加;从安全性方面,中药中农药残留、重金属及黄曲霉毒素等检测方法和限度也趋于完善。中药质控体系的完善一定程度上引导和倒逼生产企业从源头上加强生产规范性,促进了中药产品质量的提升,这一点在近十年来全国中药抽验结果数据上有明显体现。2013~2021年由中国食品药品检定研究院中药民族药检定所(以下简称中检院中药所)统计的我国中药材及饮片总体合格率分别为:64%、68%、75%、77%、84%、88%、91%、96%、97%,呈现合格率逐年提高、稳步向好的趋势。2008~2021年18个中成药国抽品种检验结果表明:18个品种共计抽检2149批次样品按照《中国药典》等国家药品标准进行检测,除牛黄镇惊丸、跌打活血散的合格率分别为62.5%、82.9%外,其余品种合格率均在95%以上,甚至有9个品种合格率达到100%,总体市场情况良好。
充分肯定中药质控体系发展的同时,在深入研究中发现中药质控体系仍然存在一些尚未阐明的问题,这也使得现有中药质控体系的合理性受到质疑。主要未阐明的问题在于:①标准中设定的指标成分是否可以有效的反映中药质量。鉴于部分指标成分与中药质量、疗效相关性不明确,认为仅以一个或几个指标成分代表中药质量这种模式,合理性欠佳。并且指标性成分的选择原则也并不清晰,可能是因为此化学成分在某一方面具有活性,或者仅是因为其在药材中含量较高,易被提取。②难以对中药产品的优劣进行评价。标准更多是从真伪方面对产品进行判断,设定的标准限度为低限水平。长期以来,中药产品抽验结果显示其合格率虽高,但深入研究发现中药整体质量重心下移,生产企业以生产出符合《中国药典》要求的产品为目的。故根据中药产品特点,探索影响中药质量的核心因素,厘清中药质量内涵,寻找与中药材或饮片质量属性相关性强、代表性好的指标,建立适用性强、可反映产品真伪优劣、质量可控的检测技术,是中药质量评价的重点研究方向。
3近十年来中药质量控制模式的发展
鉴于中药成分的多样性及作用机制的复杂性,中药质控体系研究的确面临诸多难题,但广大科研工作者对中药质控模式的探索与革新亦从未停止过。面临中药分析的复杂性,围绕中药质控的关键因素“真实、安全、有效、可控、优劣可分”,近些年来形成了一些系统且应用性较强的中药质量控制模式和方法,主要包括以下几个方面。
3.1  有效性和可控性
3.1.1  基于多成分整体分析的中药质控模式  质量控制项中主要以单一化学成分为指标进行质量控制是目前研究中普遍应用的一种方式,然而此模式并不符合中药 “多成分、多靶点”的作用特征。对中药质量进行整体控制,更加符合中药复杂体系的特征。从化学成分检测角度讲,要了解中药整体质量,首先要对其物质基础进行探究,近十年学者们多采用高通量质谱技术对其化学成分进行全面解析。但对于中药质控而言,如果德安教授研究团队提出的“深入研究,浅出标准”的思路,应在充分吸纳现代科学新技术、新方法研究的基础上,建立科学、准确、可操作性强的中药质量控制方法。中药指纹(特征)图谱、一测多评,对照提取物及双标多测法作为一种准确、可操作性强、在一定程度上可反映中药整体质量情况的技术,在这些年得到了快速的发展。
中药指纹(特征)图谱:中药指纹(特征)图谱是基于中药整体性控制思路出发,多采用色谱技术对其含有的化学成分进行系统的、整体的、专属的表征。现有标准操作方法表现为:特征图谱与对照品保留时间进行整体比较,从而完成对多个成分的鉴别;指纹图谱是将待测样品的测定图谱与对照品或对照品图谱进行整体比较,同时采用相似度软件对其进行量化。《中国药典》2010年版首次引入中药指纹(特征)图谱技术,至《中国药典》2020年版其中收载指纹(特征)图谱的数量增加到73个。近十年来涉及中药指纹(特征)图谱的学术研究也在不断深入,中药指纹(特征)图谱已成为反映中药内在质量整体性的成熟技术,被广泛应用于中药各类产品,以及生产、加工等各个环节的质量评价中。其优势在于在现阶段大部分有效成分未明确的情况下,尽可能全面的模糊的反映了中药整体质量情况,符合中药复杂体系的特点;并且此技术专属性强、稳定性好、重现性好;还能作为控制同一产品不同批次之间质量均一性的有效工具,反映生产工艺的稳定性。
一测多评、双标多测等替代标准物质法的应用:一测多评法(QAMS)一般是采用一种对照品作为参照物,并建立参照物与各待测组分之间的校正因子(RCF),从而达到通过使用一个对照品即可对多指标进行测定的质控技术。《中国药典》2010年版首次在黄连的含量测定项中采用QAMS,即采用一个对照品盐酸小檗碱,测得黄连中巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱的含量。至《中国药典》2015年版QAMS的使用扩展到9个品种,并在植物提取物(银杏叶提取物)、中成药(咳特灵片等)中均有使用。QAMS的优势在于化学对照品使用数量减少,简化了操作,降低实验成本,但存在方法在不同仪器、系统中耐用性不佳的问题。鉴于此,孙磊等于2013年提出将双标多测法应用于中药的质控分析,所谓双标多测法是使用2个对照品,分别用双标线性校正法进行色谱峰定性和RCF定量。如有研究以人参皂苷Rb2和人参皂苷Re为对照品,同时测定西洋参破壁饮片中的8个皂苷类成分,经验证发现此法准确性、重现性均较好。双标多测法的探索研究为解决中药质控中的对照品需求问题提供了一种新的路径,一定程度上弥补了QAMS定性与定量误差问题,具有较好的应用前景。
对照提取物的应用:中药对照提取物是指经特定提取工艺制备的含有多种有效成分或指标成分,用于中药材(含饮片)、提取物、中成药等鉴别或含量测定用标准物质。一般来讲对照提取物化学组成比例相对固定,且具有来源信息、制备工艺、理化特性等详细数据。《中国药典》2005年版首次将对照提取物用于中药的质控标准中,这是从质量标准用对照品方面中药质控体系一次大的飞跃。近十年来,对照提取物的优势逐渐凸显,其在中药质控中的应用也越来越来越广泛,至《中国药典》2020年版对照提取物的应用已增加至23个品种。不同于指纹图谱、一测多评等方法,从技术层面反映中药整体性,对照提取物作为一种整体性的实物参考,具有其突出的优势,表现在:①化学对照品使用数量少,降低成本,更易操作;②不同于对照药材,对照提取物本身是经过提取处理的,故其无需复杂的前处理步骤,操作简单也使得重现性提高;其使用时无需进行复杂的提取净化,操作简便,重现性更好。③在进行指纹图谱及一测多评时,往往需要对其色谱条件的稳定性、耐用性进行深入考察,以保证方法在不同色谱柱及不同实验室条件下可重现,而对照提取物的使用则大大提高了指纹图谱、一测多评等方法的可操作性,有利于这类技术的推广。目前在功劳木(药材)、三七总皂苷(植物提取物)以及银杏叶片(中成药)等品种项下均已使用对照提取物用于质控分析。对照提取物在中药质控中具有很好的发展前景,但目前尚处于起步阶段,其本身制备及标定工作的准确性、批间一致性是此技术推广的关键点,还需进一步开展研究。
3.1.2  基于中药质量标志物(Q-Maker)的中药质控模式  2016年刘昌孝院士提出了基于“中药质量标志物”的中药质控理念,Q-Marker以中医理论为基础、以有效性为核心、以成分的特有性为依据,从可测性及可传递溯源等方面为中药质量监管提供参考依据。Q-Marker是存在于中药材和中药产品(如饮片、提取物、成药)中固有的或加工制备过程中下形成的,与中药的功能属性密切相关的化学物质。并随着中药 Q-Marker 研究的不断发展,继而提出了Q-Marker的五要素,包括:“指纹成分-工艺过程可重现性”“生物学-有效性、安全性”“中药功效-作用机制关联性”“质量物质可测性”和“质量标准稳定性”。
通过对近年来有关中药Q-Marker研究的归纳总结,白钢等提出Q-Marker的研究策略,包括:基于药效与成分相关联的,基于生物效价相关联的,基于药代与有效性相关联的以及基于化学计量学的探索识别中药的Q-Marker。如基于药代与有效性探索识别Q-Marker,Zhang等首先通过了补阳还五汤的处方药味选择了黄芪甲苷IV、芍药苷、苦杏仁苷、川芎嗪、阿魏酸等5种候选Q-Marker,进而通过其在大鼠体内的药动学研究,发现黄芪甲苷IV具有最大的口服生物利用度,且其体内传递性类似于多药动力学行为,最终确定黄芪甲苷IV作为此方剂的Q-Marker。再如郝敏等以莪术饮片为例,对其炮制前后饮片中化学成分的差异性进行分析,结果显示:莪术经过醋炙之后,呋喃二烯等9个成分的含量发生变化;同时利用药效学实验、网络药理学分析等确定了与归经相关的质量标志物。近5年来,有关中药 Q-Marker的研究热度不断增加,迄今为止国内外学术期刊发表中英文学术论文达到 400余篇,相信Q-Marker研究思路将为提升中药及其产品质量标准和健全国家药品标准体系产生积极影响。
3.1.3  基于等级区分的中药质控模式  长期以来,中药质量评价只有低限控制这种模式,难以区分质量优劣等级,这也导致劣币驱逐良币、市场公平严重受损,不利于中药产品的高质量发展。部分中药材虽存在商品等级划分,但其评判依据主要为重量、大小、产地等,并未与内在品质真正关联。故构建以质量与安全为核心的质量等级标准是促进中药健康发展、规范市场秩序、驱动行业内部结构升级的有力工具。
近些年来随着市场药用需求以及监管部门对于药材等级评判的关注,关于中药材质量等级的研究越来越多,按照其评判原则主要可分为4类:基于性状特征、基于化学分析、基于生物活性以及基于综合分析的质量等级评价模式。中检院中药所魏锋研究员等基于长期以来对中药产品质量的探索研究及标准发展情况,首次提出了“基于传统道地性和现代生产规范性的中药材及饮片质量控制”。道地中药材是指经过中医临床长期应用优选出来的,品质和疗效更好,且质量稳定,具有较高知名度的中药材”。而生产过程的规范性是质量的保证,大多数情况下规范种植的药材质量较优。基于此观点荆文光等以“辨状论质”理论为指导建立的厚朴等级质量标准方法。传统认为优质厚朴“皮厚,肉紫,气辛,油润”,基于传统经验其采用仿生技术对皮厚和颜色进行量化,并与厚朴酚含量相关联,确定了厚朴皮的质量综合评价常数,同时对此常数作为等级评价的合理性采用药效学实验进行验证。
在中成药等级质量评价方面,中检院中药所首次提出了“基于中药对照制剂的中成药质量等级评价”。中药对照制剂系指采用道地、优质、规范加工的原料药材(饮片)和辅料,严格按照制法和生产工艺规程,并遵循药品生产质量管理规范制备的实物对照。中药对照制剂可为衡量样品中某味原料投料的真伪、优劣、多少提供更加客观的依据,还可以提供包括化学成分(群)从原料到制剂的转移率等关键信息。以牛黄清胃丸为研究对象,聂黎行等选择优质、地道的原料,严格按照标准规定的处方量和制法,在GMP车间以中试规模制备了牛黄清胃丸对照制剂。同时对多个厂家的样品进行质量分析,并根据结果拟定了牛黄清胃丸一、二等制剂的限度,形成质量等级标准草案。基于对照制剂的中成药质量等级评价方法为中成药质量控制模式的创新与发展做出了积极表率。
3.1.4  基于特征片段的中药质控模式  近年来,随着分子生物学技术、质谱技术的发展,大大扩充了中药质量评价的技术手段,尤其鉴于分子生物学及质谱技术专属性高、靶标性强的特点,此类技术可开发来解决传统性状和化学分析方法难以区分的真伪问题,使得中药质量评价技术水平大大提高。如《中国药典》2010年版阿胶项下新增了高效液相色谱质谱法(HPLC-MS/MS)法测定对阿胶的特征肽段进行测定,此方法可有效区分驴皮胶、牛皮胶和马皮胶,解决了长期以来市场阿胶掺伪的技术难题;程显隆等采用建立的质谱法对阿胶特征肽段进行测定,解决了长期以来阿胶掺伪牛皮和马匹等杂皮胶的技术难题。《中国药典》2015年版鹿角胶、龟甲胶项下亦采用了类似的检测手段,大大增加了方法的专属性。
此外,基于中药遗传信息特征的分子生物技术也发展较为迅速,如DNA分子标记技术及转录组和蛋白质组等技术。DNA分子标记技术通过研究 DNA 分子由于插入、缺失、重排、倒位、易位等机制而产生的多态性,能精准地揭示植物遗传物质的变异。目前随机扩增DNA多态性、扩增片段长度多态性、限制性内切酶片段长度多态性和DNA条形码等DNA分子标记技术已广泛应用于药材的基原鉴定和真伪评价。如《中国药典》中采用聚酶链式反应(PCR)-限制性内切酶长度多态性方法鉴别川贝母和其他品种,《中国药典》2020年版在石斛的霍山石斛这一品种项下亦新增了PCR法以区分霍山石斛与其他近似种;现有标准中PCR技术主要用于一些贵细类药材的真伪鉴别。近些年来,陈士林教授研究团队对DNA条形码技术在中药材鉴定中应用的技术方法和关键问题进行研究,并且提出DNA条形码技术作为一种新兴的生物鉴定方法,在动物药材的鉴定中有明显的优势。
3.1.5  基于“等效成分群”的中药质控模式  “等效成分群”是李萍教授研究团队于2014年提出的中药质控研究假说。此假说认为中药中虽然含有众多成分,但并非所有成分都起效,针对某些病症/药效其存在着一组成分确定、含量明确,发挥主要药效的化学成分群。故提出在研究过程中应基于药物的确定疗效,首先进行整体化学成分研究,筛选出潜在的有效成分群,进行定性、定量分析及体内外药效评价;然后结合药效研究,深入量效关系通过统计学迭代出可以代替整体宏观药效的化学成分群,最终将此成分群作为中药质控指标。如Liu等在复方丹参滴丸质控标准研究中采用“等效成分群”的思路,采用心绞痛细胞模型及大鼠心肌梗死模型筛选出18个化学成分,并对其进行含量测定,对该成分群药效活性进行评价;同时基于抗炎模型,筛选出复方丹参滴丸抗炎活性的等效成分群,即为原儿茶醛、丹参酚、二氢丹参酮Ⅰ等6个成分的集合,最终形成此成方制剂的质控标准。
“等效成分群”质控理念是对中药质量控制与评价体系研究的一次有益探索,该策略主要优势体现在:基于中药化学成分的整体性,遵循中药(复方)成分含量原始比例,反映成分(群)在中药整体中的真实状态,根据成分(群)与中药整体的活性差异,评估“部分”对“整体”的贡献,以识别可表征药效的“等效成分群”。此策略体现了中药的整体性,并且筛选的质控指标与药效关联,此理念的提出为中药质量的科学监管提供了新思路。
3.1.6  基于系统生物学技术的中药质控模式  随着交叉学科的发展,基于代谢组学及网络药理学的中药质量评价方法得到了迅速发展。代谢组学是通过分析(定性和定量)生物体内所有代谢物组成来以探索代谢途径,其核心技术是通过监测内源性代谢物的变化来评价中药对机体产生的整体效应。操作步骤为通过比较代谢物组成分图谱的变化,识别生物标志物。代谢组学从整体作用出发最大限度的从中药中获取有关化学成分信息。网络药理学是基于已有文献和数据库,采用生物信息学技术探索化学成分与药效之间的潜在关系,构建“成分-疾病-靶点”关系网,预测关键化学成分,再围绕其建立质量评价方法。如苏联麟等对五味子进行研究,通过 UPLC-Q/TOF-MS方法检测并比较生、醋五味子饮片中主要化学成分的差异性,结果表明,五味子经过醋炙后,其中的8个成分含量发生显著变化,即将其标记为化学标记物;再通过网络药理学进一步明确五味子的主要药效物质,结合化学成分分析,确定五味子饮片质控的指标成分。
近年来兴起的中医方证代谢组学是研究中药方剂有效性及其药效物质基础的整合策略,其以代谢组学技术建立方剂有效性评价体系,揭示证候生物学本质,寻找标志性成分。如王喜军教授研究团队采用中医方证代谢组学对知柏地黄丸等方剂进行研究,最终推测推测丹皮酚、没食子酸、棉子糖、芍药苷、药根碱、泽泻醇B-单乙酸酯等6种体内原型成分为知柏地黄丸治疗肾阴虚证的关键成分。基于系统生物学的质控模式,其优势在于具有整体性和系统性,以药物对机体产生的生物效应为依据,与中医药辨证论治、整体观的理念相符,为中药质控研究开辟了一条新途径。
3.1.7  基于生物活性评价的中药质控模式  生物评价方法是利用细胞、离体组织、器官、整体动物以及相关生物因子等,评价药物的生物活性,包括其有效性和毒性,从而达到药物质量评价的目的。《中国药典》自2005年版起,在中药品种中开始收录有关生物活性检测的技术,如水蛭项下采用抗凝血酶活性检测法对其生物活性进行测定;《中国药典》2010 年版编写大纲中则明确提出:“中药的质量标准要逐步由单一指标性成分定性定量测定,向活性有效成分及生物测定的综合检测过渡”,并在附录新增了《中药生物活性测定指导原则》,首次指出将生物活性评价方法作为中药质量控制的具体原则。《中国药典》2015年版新增了“基于基因芯片的药物评价技术与方法指导”和“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”,充分肯定了生物测定在中药质量评价体系构建中的作用与价值。
肖小河研究团队提出了以“生物检定法”和“药理学评价体系”评估中药材质量优劣,同时构建了泻下、抗炎、止血、抑菌、抗病毒、肝细胞毒价等一系列评价模型,以评价中药材的功效与毒性,并建议在《中国药典》中引入生物效应评测、效应成分指数等评价方法。生物活性测定方法的优势在于,其不以中药复杂的化学体系为切入点,而是将复杂的中药成分作为“黑箱”,直接以药效为切入点评价药材品质。但生物活性测定法用于中药质量评价仍存在一些问题,如目前尚缺少生物测定用的中药标准品;对于存在多种适应症的中药,应如何去建立相应的生物活性检测方法;现有生物活性检测方法还较为单一,仅包括抗菌、抗凝血、抗炎等简单药理模型,对于复杂的中医药功效,尚未建立可靠的药理评价模型。虽然生物活性检测法起步较晚,发展尚不完善,但其是中药质量评价体系的重要组成部分。尤其是对于功能主治明确、化学检测方法尚不完善的中药,生物活性检测法是很重要的补充。
3.2  安全性方面
一直以来中药安全性是监管的热点和难点问题,从物质成分方面看,中药中引起药用安全性问题的物质主要包括外源性有害物质和内源性有毒物质和。国家药监局于2023年1月发布的《关于印发进一步加强中药科学监管促进中药传承创新发展若干措施的通知》(国药监药注〔2023〕1号)在对进一步科学完善中药标准中指出:“合理设置中药中农药残留、重金属与有害元素、真菌毒素等有害物质以及植物生长调节剂等的限量要求和检测方法。加强中药内源性有毒成分检测技术研究和风险评估体系建设,制订符合中药特点的内源性有毒成分限度标准和完善用法用量”。故建立符合中药特点的外源性有害物质和内源性有毒成分的限量标准,以及开展相应的风险评估工作是完善中药标准、提升中药标准管理水平的关键。
3.2.1  基于符合中药使用特点的外源性污染物限量标准  外源性有害物质主要是中药在种植、贮藏、运输等过程中造成的污染,主要包括农药残留、重金属及有害元素、真菌毒素等。近些年来,随着社会对中药用药安全性的不断关注,通过药监部门及研究机构十余年的努力,现有中药标准体系中外源性有害物检测技术及限量标准的更新是递进式逐步完善。中检院中药所在国家“十一五”“十二五”及“十三五”重大新药创制项目及国家药典会标准提高任务的支持下,通过近十年的努力在建立中药中外源性有害物检测平台的基础上,进一步对外源性污染物最大残留限量标准的修订以及风险评估体系的构建进行研究,并将其应用于中药中农药、重金属的风险评估工作]。同时基于风险评估数据,中检院中药所参与修订了《中国药典》2020年版四部“9302中药有害残留物限量制定指导原则”,结合中药使用特点(考虑中药服用频率和服用年限),提出了有害残留物最大限量的理论计算公式,见公式1。
L=A×WM×SF×ATEF×ED×1t(公式1)
式中L为最大限量理论值(mg/kg);A为每日允许摄入量(mg/kg bw);W为人体平均体重(kg),—般按63 kg计;M为中药材(饮片)每日人均可服用的最大剂量(kg);SF为安全因子,农药的安全因子规定为100;AT为平均寿命天数,一般为365天×70年;EF为中药材或饮片服用频率(每年多少天);ED为一生服用中药的暴露年限;t为中药材及饮片经煎煮或提取后农药的转移率(%);安全因子是指每日由中药材及其制品中摄取的农药残留量或重金属残留量所占日总暴露量(包括食物和饮用水)的比例。农药的安全因子规定为100,即表示由中药材及其制品中摄取的农药残留量不超过日总暴露量(包括食物和饮用水)的1%;重金属的安全因子为10。同时根据调研数据及国际权威毒理学研究数据,提出了中药中重金属及有害元素的一致性限度指导值,即规定药材及饮片(植物类)中铅不得过5 mg/kg,镉不得过1 mg/kg,砷不得过2 mg/kg,汞不得过0.2 mg/kg,铜不得过20 mg/kg。
然而大多数中药中的毒性成分以及毒性机制尚不清楚,故难以制定其毒性成分的限量值,导致药用安全存在一定隐患。近些年已有学者开展了中药中内源性有毒成分检测方法及限度值的研究,如刘静等建立天仙藤中5种马兜铃酸类成分的LC-MS/MS测定法;杨建波等采用HPLC法同时对何首乌中大黄素8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚、游离蒽醌和结合蒽醌的含量进行测定;昝珂等采用液质联用技术建立了中药中吡咯里西啶类生物碱的检测方法,并对25种常用中药材进行了吡咯里西啶类生物碱的筛查。由此可见,随着检测手段的发展,中药中毒性成分的检测技术已较为成熟,进一步如何对中药中的毒性成分进行合理评价,同时兼顾效益风险评价原则制定有毒中药科学、合理的限度值,是中药安全性监控所关注的重点问题。
4中药质控模式创新还应关注的发展方向
综上所述,近十年来中药质量控制模式的瓶颈问题有了很大的突破,质控体系已经向更深层次、更科学合理的方向迈进,通过与现代前沿技术的结合逐渐解决了“丸散膏丹、神仙难辨”以及“有效成分说不清、道不明”的困境。然而中药的发展也是随着人类认知的进步不断向前的,随着新型技术的推进,建立符合中药特点的质控体系还要关注以下一些重点方向。
4.1  拓展数字化在中药质控体系构建中的应用
随着网络信息技术的飞速发展,数字化成了中药发展的必然趋势。相较于传统的中药鉴别方法,即评价方式多为模糊化、主观化的评判方法,构建的数字化体系更加具备客观性、规范性,可有效提高中药检验工作效率;且具有远程共享、智能识别等功能。目前已有学者开展了数字化标本馆、数字化标准物质(DRS)及数字化指纹图谱等的研究,并探索将其应用于中药质量评价。①数字标本馆是将各种原标本形态转化成数字信息进行存储,以计算机技术进入标本馆并提供服务,本地用户和远程用户可通过网络平台读取数字标本信息。中药数字标本馆的构建是其应用于质量控制的前提,近些年各研究部门积极开展了相应的工作,如康帅等应用体式荧光显微镜及数码成像技术对覆盆子聚合果及小核果的外观性状(正面观、侧面观、顶面观、基面观、表面构造)及内在构造(横剖面、纵剖面)进行观察和表征,并对此类信息进行数字化表达,为智能识别技术奠定基础。②DRS是实物标准物质的数字化、数据化、互联网化及智能化形式,以实物标准物质,应用于日常中药的定性和定量分析。DRS系统不仅存储了化合物的色谱行为,更存储了大量不同型号规格色谱柱的图谱信息,继而以这些信息为基础,建立适当的模型,供研究者对样品进行定性和定量分析。③数字化指纹图谱是利用数学原理或方法对指纹图谱本质特征进行定义、表达、重组、模拟等处理的过程,将检测方法和仪器检测的信号数据转化为容易鉴别且能揭示中药复杂信息特征的数字化信息。如邹纯才等以大黄为研究对象,利用特征峰的相对保留时间建立了其数字化指纹图谱。
4.2  重视数据统计在中药指标成分识别中的应用
数据统计分析是中药“谱效关系”研究、指标成分识别的重要手段,现有常用的数据分析技术包括:灰色关联度分析、主成分分析、聚类分析、人工神经网络等。一般情况下选择何种方法进行统计分析,主要根据实验目的及使用范围,其中主成分分析、聚类分析多用于判断化学成分对药效贡献的大小。如张华锋等采用聚类分析法研究了北柴胡保肝作用的谱效关系,最终得出保肝生化指标与柴胡皂苷a、柴胡皂苷d具有较高的相关性,认为基于保肝作用应以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d作为主要质控指标。灰色关联度分析法、人工神经网络等主要用于预测各成分与药效之间的关联度。如马雯芳等采用人工神经网络法研究滇桂艾纳香止血作用的谱效关系,找到与止血作用密切相关的色谱峰,继而通过人工神经网络 MATLAB 软件建立谱效关系模型,实现在质控过程中,输入指纹图谱信息即可对其止血作用进行质量评价。偏最小二乘回归分析法和多元线性回归法是阐明各化学成分对药效贡献率的分析方法。如徐硕等采用灰色关联度对罗布麻叶指纹图谱与其体外抗氧化活性的谱效关系进行研究,筛选出罗布麻叶抗氧化作用的活性物质主要为绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和山柰酚等成分。
4.3  基于“真实世界”研究,建立符合临床药用特点的质控标准
中药质量控制的终极目标是保证临床用药的安全有效,故在探索中药质量体系建立中应充分基于临床数据,这是进一步进行中药精准控制的重要举措。如肖小河课题组提出了评价指标与临床疗效关联程度的评控力原则,认为应以临床为导向构建中药质控体系,进而创建了中药质量整合评控力金字塔及中药优质性评价体系。鄢丹等基于临床生物特征谱学构建了中药质量评价体系,如利用等温滴定动态监测技术检测注射用益气复脉(冻干)的质量波动,此体系可与临床“真实世界”的中药疗效整体评价相关联。孙昱等亦提出基于疾病不同阶段的以中药功效为抓手的中药质量评价方法,分阶段进行“药性-功效成分-功效-作用机制”的药性与功效的关联性研究。
4.4  重视传统药效部位成分的研究
中药的传统服方式是水煎煮,煎煮后的药汤中多糖是其主要成分。中药多糖广泛存在于菌类、藻类、根茎类,以及果实种子类等药材中,并被确证具有较强的药理活性。同时中药多糖还是中药中的主要成分,如玉竹、黄精及铁皮石斛等药材中多糖含量达到6%以上。然而,目前构建的中药质控体系中的指标性成分多为小分子化合物,有关中药多糖质控体系的建立尚处于空白状态。现行《中国药典》标准中对于多糖的控制仅采用苯酚硫酸或蒽酮硫酸比色法控制其总量,此法的专属性和准确性均不佳,多糖质控技术的滞后已成为多糖类新药研发的瓶颈问题。随着近十年来研究人员对于中药多糖领域的不断关注,分别提出了糖谱和多糖多元指纹图谱的概念。此类方法运用传统分析技术,同时结合酶解法和数学统计法以达到对多糖结构分析目的。总的来说,中药多糖质控技术是整个中药质量评价的关键组成部分,亦是现有质控体系的薄弱环节,故发展中药中多糖类成分检测技术关乎中药质控体系的完整性。
5结  语
国家中医药创新战略的重要性赋予了中药质量评价研究重大的契机;离子淌度质谱、质谱成像、二维色谱分离技术等现代前沿技术的蓬勃发展,中药分析领域学者高昂的研究热情,带给了中药质量评价关键问题突破新的希望。“传承精华,守正创新”的发展战略在中医药研究上尤为重要。新时代的中药研究者需继承中医药朴素的人文情怀与整体观哲学思维,同时要以开阔的视野吸纳现代科技的新思路、新技术,促进多学科融合,迎难而上突破关键技术,解决瓶颈问题,为提升中药产品质量,保证人民用药安全,实现中药产业的国际化发展奠定基础。
(来源:《中国药学杂志》 作者:马双成、王莹、魏锋中国食品药品检定研究院)

       从宋·辛弃疾的“云母屏开,珍珠帘闭,防风吹散沉香”到清·蒲松龄的“冬虫夏草名符实,变化生成一气通”,中医药孕育滋生于中华民族的历史长河,秉承着朴素的民族精神,与中华民族深厚的文化底蕴、人文智慧一脉相承。从古至今中医药在人类疾病防治中发挥了重大作用,是中华民族的宝贵财富。在2019年暴发的新冠肺炎疫情中,中医药更是运用其辨证施治理论,在疫情防控中发挥了不可替代的重大作用。在2022年世界卫生组织发布的《世界卫生组织中医药救治新冠肺炎专家评估会报告》充分肯定了中医药抗击新冠疫情的重要贡献。这是中医药的又一次重大实践,更是中医药智慧的体现。同时,近些年来国家对中医药发展的重视程度不断增加,为引导和支持中医药产业的发展,相关部门针对中药产业出台一系列政策,如《中医药发展战略规划纲要(2016~2030)》于2016年发布,《中华人民共和国中医药法》于2017年正式实施,在2019年和2021年中共中央分别印发了《中共中央国务院关于促进中医药传承创新发展的意见》和《关于加快中医药特色发展若干政策措施》。2022年发布的“十四五中医药发展规划”突出了提升中药质控水平是中药研究的主要任务之一。党的二十大大会报告再一次提到了“促进中医药传承创新发展”。由此可见,近年来振兴中医药事业战略已逐步实施,中医药产业迎来了发展的黄金时期。

       中医药高质量发展的关键核心是建立科学合理的中药质量评价体系和高质量的评价标准,只有不断创新和完善中药质量评价模式,才能实现对中医药产业的正向引导,保证中药使用的安全有效。随着分析技术和仪器检测水平的不断提高,近些年来中药质量控制体系已经得到了充分的发展,尤其体现为中药质量标准的完善和质量评价理念的革新。但由于中药成分多样、作用机制复杂,如何采用现代技术有效、合理地去体现中药整体的、辨证的,特异性的理念;同时又兼备药品质控技术应具备的可操作、稳定、准确的特征,一直是制约着中药质控体系发展的瓶颈问题。

       笔者从事中药质量监管与检验事业三十载,秉承为中药质控体系创新建言献策的宗旨,在本综述中对中药质量标准现有体系及尚存在的问题进行剖析,并梳理了近十年来中药质控领域形成的较为系统的新模式方法,展望了科学技术高速发展的未来中药领域应重点关注的方向,以期为中药质量评价拓宽思路,为促进中药高质量发展贡献力量。

       1 中药质量控制现有模式

       随着分析技术的不断发展,中药的质量评价方式逐步从传统鉴别模式(性状、显微)发展为可准确量化的指标成分分析。现有的中药质量控制模式多采用传统经验鉴别与化学成分分析相结合的方式。所谓传统的经验鉴别即通过对中药的外观性状、颜色、气味等形态特征进行初步评价。而自20世纪70年代,随着光谱、色谱技术的不断普及,中药质控模式逐步借鉴化学药、天然药物的质控方法,即对其中的相关成分采用光谱、色谱技术进行测定。这种质控模式一直延续至今,尤其体现在现有的中药质量标准中。以《中国药典》中药材的质控标准为例,质控项目主要包括:名称、来源、性状、鉴别、检查、含量测定等,其中鉴别(如薄层鉴别)及含量测定项多采用光谱或色谱的方法对其中的指标性成分进行定性或定量分析。中成药是中药材的终产品,除了覆盖药材一般检验项目外,还要增加涉及其药品剂型相应的质控项目。综上所述,从现有标准质控的项目来看,药典标准以保证中药产品的安全性、真实性、有效性和稳定可控为主要目标。

       从检测技术来看,近些年来新技术、新方法在中药质量控制中的应用显著增加,2000年前颁布的《中国药典》主要以传统性状、显微鉴别为主结合薄层色谱法以实现对药材的真伪鉴别;自《中国药典》2000年版以来,色谱法尤其是高效液相色谱法(HPLC)广泛地应用于中药(药材、提取物及中成药)中指标成分的定性及定量分析。据统计,《中国药典》1995年版仅在化橘红等5个品种项下采用HPLC进行含量测定,到2000年版增加到105个品种,到2005年版更是在518个中药品种项下都采用了HPLC法进行分析。HPLC快速易操作、方法准确稳定、耐用性佳等特点使其成为中药质控的首选方法。

       2 中药现有质控模式尚存在的问题分析

       总的来说,近些年来中药质控体系在不断的完善与进步。从有效、稳定可控方面,标准收录各品种的指标性成分测定项目数量大大增加;从安全性方面,中药中农药残留、重金属及黄曲霉毒素等检测方法和限度也趋于完善。中药质控体系的完善一定程度上引导和倒逼生产企业从源头上加强生产规范性,促进了中药产品质量的提升,这一点在近十年来全国中药抽验结果数据上有明显体现。2013~2021年由中国食品药品检定研究院中药民族药检定所(以下简称中检院中药所)统计的我国中药材及饮片总体合格率分别为:64%、68%、75%、77%、84%、88%、91%、96%、97%,呈现合格率逐年提高、稳步向好的趋势。2008~2021年18个中成药国抽品种检验结果表明:18个品种共计抽检2149批次样品按照《中国药典》等国家药品标准进行检测,除牛黄镇惊丸、跌打活血散的合格率分别为62.5%、82.9%外,其余品种合格率均在95%以上,甚至有9个品种合格率达到100%,总体市场情况良好。

       充分肯定中药质控体系发展的同时,在深入研究中发现中药质控体系仍然存在一些尚未阐明的问题,这也使得现有中药质控体系的合理性受到质疑。主要未阐明的问题在于:①标准中设定的指标成分是否可以有效的反映中药质量。鉴于部分指标成分与中药质量、疗效相关性不明确,认为仅以一个或几个指标成分代表中药质量这种模式,合理性欠佳。并且指标性成分的选择原则也并不清晰,可能是因为此化学成分在某一方面具有活性,或者仅是因为其在药材中含量较高,易被提取。②难以对中药产品的优劣进行评价。标准更多是从真伪方面对产品进行判断,设定的标准限度为低限水平。长期以来,中药产品抽验结果显示其合格率虽高,但深入研究发现中药整体质量重心下移,生产企业以生产出符合《中国药典》要求的产品为目的。故根据中药产品特点,探索影响中药质量的核心因素,厘清中药质量内涵,寻找与中药材或饮片质量属性相关性强、代表性好的指标,建立适用性强、可反映产品真伪优劣、质量可控的检测技术,是中药质量评价的重点研究方向。

       3 近十年来中药质量控制模式的发展

       鉴于中药成分的多样性及作用机制的复杂性,中药质控体系研究的确面临诸多难题,但广大科研工作者对中药质控模式的探索与革新亦从未停止过。面临中药分析的复杂性,围绕中药质控的关键因素“真实、安全、有效、可控、优劣可分”,近些年来形成了一些系统且应用性较强的中药质量控制模式和方法,主要包括以下几个方面。

       3.1  有效性和可控性

       3.1.1  基于多成分整体分析的中药质控模式  质量控制项中主要以单一化学成分为指标进行质量控制是目前研究中普遍应用的一种方式,然而此模式并不符合中药 “多成分、多靶点”的作用特征。对中药质量进行整体控制,更加符合中药复杂体系的特征。从化学成分检测角度讲,要了解中药整体质量,首先要对其物质基础进行探究,近十年学者们多采用高通量质谱技术对其化学成分进行全面解析。但对于中药质控而言,如果德安教授研究团队提出的“深入研究,浅出标准”的思路,应在充分吸纳现代科学新技术、新方法研究的基础上,建立科学、准确、可操作性强的中药质量控制方法。中药指纹(特征)图谱、一测多评,对照提取物及双标多测法作为一种准确、可操作性强、在一定程度上可反映中药整体质量情况的技术,在这些年得到了快速的发展。

       中药指纹(特征)图谱:中药指纹(特征)图谱是基于中药整体性控制思路出发,多采用色谱技术对其含有的化学成分进行系统的、整体的、专属的表征。现有标准操作方法表现为:特征图谱与对照品保留时间进行整体比较,从而完成对多个成分的鉴别;指纹图谱是将待测样品的测定图谱与对照品或对照品图谱进行整体比较,同时采用相似度软件对其进行量化。《中国药典》2010年版首次引入中药指纹(特征)图谱技术,至《中国药典》2020年版其中收载指纹(特征)图谱的数量增加到73个。近十年来涉及中药指纹(特征)图谱的学术研究也在不断深入,中药指纹(特征)图谱已成为反映中药内在质量整体性的成熟技术,被广泛应用于中药各类产品,以及生产、加工等各个环节的质量评价中。其优势在于在现阶段大部分有效成分未明确的情况下,尽可能全面的模糊的反映了中药整体质量情况,符合中药复杂体系的特点;并且此技术专属性强、稳定性好、重现性好;还能作为控制同一产品不同批次之间质量均一性的有效工具,反映生产工艺的稳定性。

       一测多评、双标多测等替代标准物质法的应用:一测多评法(QAMS)一般是采用一种对照品作为参照物,并建立参照物与各待测组分之间的校正因子(RCF),从而达到通过使用一个对照品即可对多指标进行测定的质控技术。《中国药典》2010年版首次在黄连的含量测定项中采用QAMS,即采用一个对照品盐酸小檗碱,测得黄连中巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱的含量。至《中国药典》2015年版QAMS的使用扩展到9个品种,并在植物提取物(银杏叶提取物)、中成药(咳特灵片等)中均有使用。QAMS的优势在于化学对照品使用数量减少,简化了操作,降低实验成本,但存在方法在不同仪器、系统中耐用性不佳的问题。鉴于此,孙磊等于2013年提出将双标多测法应用于中药的质控分析,所谓双标多测法是使用2个对照品,分别用双标线性校正法进行色谱峰定性和RCF定量。如有研究以人参皂苷Rb2和人参皂苷Re为对照品,同时测定西洋参破壁饮片中的8个皂苷类成分,经验证发现此法准确性、重现性均较好。双标多测法的探索研究为解决中药质控中的对照品需求问题提供了一种新的路径,一定程度上弥补了QAMS定性与定量误差问题,具有较好的应用前景。

       对照提取物的应用:中药对照提取物是指经特定提取工艺制备的含有多种有效成分或指标成分,用于中药材(含饮片)、提取物、中成药等鉴别或含量测定用标准物质。一般来讲对照提取物化学组成比例相对固定,且具有来源信息、制备工艺、理化特性等详细数据。《中国药典》2005年版首次将对照提取物用于中药的质控标准中,这是从质量标准用对照品方面中药质控体系一次大的飞跃。近十年来,对照提取物的优势逐渐凸显,其在中药质控中的应用也越来越来越广泛,至《中国药典》2020年版对照提取物的应用已增加至23个品种。不同于指纹图谱、一测多评等方法,从技术层面反映中药整体性,对照提取物作为一种整体性的实物参考,具有其突出的优势,表现在:①化学对照品使用数量少,降低成本,更易操作;②不同于对照药材,对照提取物本身是经过提取处理的,故其无需复杂的前处理步骤,操作简单也使得重现性提高;其使用时无需进行复杂的提取净化,操作简便,重现性更好。③在进行指纹图谱及一测多评时,往往需要对其色谱条件的稳定性、耐用性进行深入考察,以保证方法在不同色谱柱及不同实验室条件下可重现,而对照提取物的使用则大大提高了指纹图谱、一测多评等方法的可操作性,有利于这类技术的推广。目前在功劳木(药材)、三七总皂苷(植物提取物)以及银杏叶片(中成药)等品种项下均已使用对照提取物用于质控分析。对照提取物在中药质控中具有很好的发展前景,但目前尚处于起步阶段,其本身制备及标定工作的准确性、批间一致性是此技术推广的关键点,还需进一步开展研究。

       3.1.2  基于中药质量标志物(Q-Maker)的中药质控模式  2016年刘昌孝院士提出了基于“中药质量标志物”的中药质控理念,Q-Marker以中医理论为基础、以有效性为核心、以成分的特有性为依据,从可测性及可传递溯源等方面为中药质量监管提供参考依据。Q-Marker是存在于中药材和中药产品(如饮片、提取物、成药)中固有的或加工制备过程中下形成的,与中药的功能属性密切相关的化学物质。并随着中药 Q-Marker 研究的不断发展,继而提出了Q-Marker的五要素,包括:“指纹成分-工艺过程可重现性”“生物学-有效性、安全性”“中药功效-作用机制关联性”“质量物质可测性”和“质量标准稳定性”。

       通过对近年来有关中药Q-Marker研究的归纳总结,白钢等提出Q-Marker的研究策略,包括:基于药效与成分相关联的,基于生物效价相关联的,基于药代与有效性相关联的以及基于化学计量学的探索识别中药的Q-Marker。如基于药代与有效性探索识别Q-Marker,Zhang等首先通过了补阳还五汤的处方药味选择了黄芪甲苷IV、芍药苷、苦杏仁苷、川芎嗪、阿魏酸等5种候选Q-Marker,进而通过其在大鼠体内的药动学研究,发现黄芪甲苷IV具有最大的口服生物利用度,且其体内传递性类似于多药动力学行为,最终确定黄芪甲苷IV作为此方剂的Q-Marker。再如郝敏等以莪术饮片为例,对其炮制前后饮片中化学成分的差异性进行分析,结果显示:莪术经过醋炙之后,呋喃二烯等9个成分的含量发生变化;同时利用药效学实验、网络药理学分析等确定了与归经相关的质量标志物。近5年来,有关中药 Q-Marker的研究热度不断增加,迄今为止国内外学术期刊发表中英文学术论文达到 400余篇,相信Q-Marker研究思路将为提升中药及其产品质量标准和健全国家药品标准体系产生积极影响。

       3.1.3  基于等级区分的中药质控模式  长期以来,中药质量评价只有低限控制这种模式,难以区分质量优劣等级,这也导致劣币驱逐良币、市场公平严重受损,不利于中药产品的高质量发展。部分中药材虽存在商品等级划分,但其评判依据主要为重量、大小、产地等,并未与内在品质真正关联。故构建以质量与安全为核心的质量等级标准是促进中药健康发展、规范市场秩序、驱动行业内部结构升级的有力工具。

       近些年来随着市场药用需求以及监管部门对于药材等级评判的关注,关于中药材质量等级的研究越来越多,按照其评判原则主要可分为4类:基于性状特征、基于化学分析、基于生物活性以及基于综合分析的质量等级评价模式。中检院中药所魏锋研究员等基于长期以来对中药产品质量的探索研究及标准发展情况,首次提出了“基于传统道地性和现代生产规范性的中药材及饮片质量控制”。道地中药材是指经过中医临床长期应用优选出来的,品质和疗效更好,且质量稳定,具有较高知名度的中药材”。而生产过程的规范性是质量的保证,大多数情况下规范种植的药材质量较优。基于此观点荆文光等以“辨状论质”理论为指导建立的厚朴等级质量标准方法。传统认为优质厚朴“皮厚,肉紫,气辛,油润”,基于传统经验其采用仿生技术对皮厚和颜色进行量化,并与厚朴酚含量相关联,确定了厚朴皮的质量综合评价常数,同时对此常数作为等级评价的合理性采用药效学实验进行验证。

       在中成药等级质量评价方面,中检院中药所首次提出了“基于中药对照制剂的中成药质量等级评价”。中药对照制剂系指采用道地、优质、规范加工的原料药材(饮片)和辅料,严格按照制法和生产工艺规程,并遵循药品生产质量管理规范制备的实物对照。中药对照制剂可为衡量样品中某味原料投料的真伪、优劣、多少提供更加客观的依据,还可以提供包括化学成分(群)从原料到制剂的转移率等关键信息。以牛黄清胃丸为研究对象,聂黎行等选择优质、地道的原料,严格按照标准规定的处方量和制法,在GMP车间以中试规模制备了牛黄清胃丸对照制剂。同时对多个厂家的样品进行质量分析,并根据结果拟定了牛黄清胃丸一、二等制剂的限度,形成质量等级标准草案。基于对照制剂的中成药质量等级评价方法为中成药质量控制模式的创新与发展做出了积极表率。

       3.1.4  基于特征片段的中药质控模式  近年来,随着分子生物学技术、质谱技术的发展,大大扩充了中药质量评价的技术手段,尤其鉴于分子生物学及质谱技术专属性高、靶标性强的特点,此类技术可开发来解决传统性状和化学分析方法难以区分的真伪问题,使得中药质量评价技术水平大大提高。如《中国药典》2010年版阿胶项下新增了高效液相色谱质谱法(HPLC-MS/MS)法测定对阿胶的特征肽段进行测定,此方法可有效区分驴皮胶、牛皮胶和马皮胶,解决了长期以来市场阿胶掺伪的技术难题;程显隆等采用建立的质谱法对阿胶特征肽段进行测定,解决了长期以来阿胶掺伪牛皮和马匹等杂皮胶的技术难题。《中国药典》2015年版鹿角胶、龟甲胶项下亦采用了类似的检测手段,大大增加了方法的专属性。

       此外,基于中药遗传信息特征的分子生物技术也发展较为迅速,如DNA分子标记技术及转录组和蛋白质组等技术。DNA分子标记技术通过研究 DNA 分子由于插入、缺失、重排、倒位、易位等机制而产生的多态性,能精准地揭示植物遗传物质的变异。目前随机扩增DNA多态性、扩增片段长度多态性、限制性内切酶片段长度多态性和DNA条形码等DNA分子标记技术已广泛应用于药材的基原鉴定和真伪评价。如《中国药典》中采用聚酶链式反应(PCR)-限制性内切酶长度多态性方法鉴别川贝母和其他品种,《中国药典》2020年版在石斛的霍山石斛这一品种项下亦新增了PCR法以区分霍山石斛与其他近似种;现有标准中PCR技术主要用于一些贵细类药材的真伪鉴别。近些年来,陈士林教授研究团队对DNA条形码技术在中药材鉴定中应用的技术方法和关键问题进行研究,并且提出DNA条形码技术作为一种新兴的生物鉴定方法,在动物药材的鉴定中有明显的优势。

       3.1.5  基于“等效成分群”的中药质控模式  “等效成分群”是李萍教授研究团队于2014年提出的中药质控研究假说。此假说认为中药中虽然含有众多成分,但并非所有成分都起效,针对某些病症/药效其存在着一组成分确定、含量明确,发挥主要药效的化学成分群。故提出在研究过程中应基于药物的确定疗效,首先进行整体化学成分研究,筛选出潜在的有效成分群,进行定性、定量分析及体内外药效评价;然后结合药效研究,深入量效关系通过统计学迭代出可以代替整体宏观药效的化学成分群,最终将此成分群作为中药质控指标。如Liu等在复方丹参滴丸质控标准研究中采用“等效成分群”的思路,采用心绞痛细胞模型及大鼠心肌梗死模型筛选出18个化学成分,并对其进行含量测定,对该成分群药效活性进行评价;同时基于抗炎模型,筛选出复方丹参滴丸抗炎活性的等效成分群,即为原儿茶醛、丹参酚、二氢丹参酮Ⅰ等6个成分的集合,最终形成此成方制剂的质控标准。

       “等效成分群”质控理念是对中药质量控制与评价体系研究的一次有益探索,该策略主要优势体现在:基于中药化学成分的整体性,遵循中药(复方)成分含量原始比例,反映成分(群)在中药整体中的真实状态,根据成分(群)与中药整体的活性差异,评估“部分”对“整体”的贡献,以识别可表征药效的“等效成分群”。此策略体现了中药的整体性,并且筛选的质控指标与药效关联,此理念的提出为中药质量的科学监管提供了新思路。

       3.1.6  基于系统生物学技术的中药质控模式  随着交叉学科的发展,基于代谢组学及网络药理学的中药质量评价方法得到了迅速发展。代谢组学是通过分析(定性和定量)生物体内所有代谢物组成来以探索代谢途径,其核心技术是通过监测内源性代谢物的变化来评价中药对机体产生的整体效应。操作步骤为通过比较代谢物组成分图谱的变化,识别生物标志物。代谢组学从整体作用出发最大限度的从中药中获取有关化学成分信息。网络药理学是基于已有文献和数据库,采用生物信息学技术探索化学成分与药效之间的潜在关系,构建“成分-疾病-靶点”关系网,预测关键化学成分,再围绕其建立质量评价方法。如苏联麟等对五味子进行研究,通过 UPLC-Q/TOF-MS方法检测并比较生、醋五味子饮片中主要化学成分的差异性,结果表明,五味子经过醋炙后,其中的8个成分含量发生显著变化,即将其标记为化学标记物;再通过网络药理学进一步明确五味子的主要药效物质,结合化学成分分析,确定五味子饮片质控的指标成分。

       近年来兴起的中医方证代谢组学是研究中药方剂有效性及其药效物质基础的整合策略,其以代谢组学技术建立方剂有效性评价体系,揭示证候生物学本质,寻找标志性成分。如王喜军教授研究团队采用中医方证代谢组学对知柏地黄丸等方剂进行研究,最终推测推测丹皮酚、没食子酸、棉子糖、芍药苷、药根碱、泽泻醇B-单乙酸酯等6种体内原型成分为知柏地黄丸治疗肾阴虚证的关键成分。基于系统生物学的质控模式,其优势在于具有整体性和系统性,以药物对机体产生的生物效应为依据,与中医药辨证论治、整体观的理念相符,为中药质控研究开辟了一条新途径。

       3.1.7  基于生物活性评价的中药质控模式  生物评价方法是利用细胞、离体组织、器官、整体动物以及相关生物因子等,评价药物的生物活性,包括其有效性和毒性,从而达到药物质量评价的目的。《中国药典》自2005年版起,在中药品种中开始收录有关生物活性检测的技术,如水蛭项下采用抗凝血酶活性检测法对其生物活性进行测定;《中国药典》2010 年版编写大纲中则明确提出:“中药的质量标准要逐步由单一指标性成分定性定量测定,向活性有效成分及生物测定的综合检测过渡”,并在附录新增了《中药生物活性测定指导原则》,首次指出将生物活性评价方法作为中药质量控制的具体原则。《中国药典》2015年版新增了“基于基因芯片的药物评价技术与方法指导”和“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”,充分肯定了生物测定在中药质量评价体系构建中的作用与价值。

       肖小河研究团队提出了以“生物检定法”和“药理学评价体系”评估中药材质量优劣,同时构建了泻下、抗炎、止血、抑菌、抗病毒、肝细胞毒价等一系列评价模型,以评价中药材的功效与毒性,并建议在《中国药典》中引入生物效应评测、效应成分指数等评价方法。生物活性测定方法的优势在于,其不以中药复杂的化学体系为切入点,而是将复杂的中药成分作为“黑箱”,直接以药效为切入点评价药材品质。但生物活性测定法用于中药质量评价仍存在一些问题,如目前尚缺少生物测定用的中药标准品;对于存在多种适应症的中药,应如何去建立相应的生物活性检测方法;现有生物活性检测方法还较为单一,仅包括抗菌、抗凝血、抗炎等简单药理模型,对于复杂的中医药功效,尚未建立可靠的药理评价模型。虽然生物活性检测法起步较晚,发展尚不完善,但其是中药质量评价体系的重要组成部分。尤其是对于功能主治明确、化学检测方法尚不完善的中药,生物活性检测法是很重要的补充。

       3.2  安全性方面

       一直以来中药安全性是监管的热点和难点问题,从物质成分方面看,中药中引起药用安全性问题的物质主要包括外源性有害物质和内源性有毒物质和。国家药监局于2023年1月发布的《关于印发进一步加强中药科学监管促进中药传承创新发展若干措施的通知》(国药监药注〔2023〕1号)在对进一步科学完善中药标准中指出:“合理设置中药中农药残留、重金属与有害元素、真菌毒素等有害物质以及植物生长调节剂等的限量要求和检测方法。加强中药内源性有毒成分检测技术研究和风险评估体系建设,制订符合中药特点的内源性有毒成分限度标准和完善用法用量”。故建立符合中药特点的外源性有害物质和内源性有毒成分的限量标准,以及开展相应的风险评估工作是完善中药标准、提升中药标准管理水平的关键。

       3.2.1  基于符合中药使用特点的外源性污染物限量标准  外源性有害物质主要是中药在种植、贮藏、运输等过程中造成的污染,主要包括农药残留、重金属及有害元素、真菌毒素等。近些年来,随着社会对中药用药安全性的不断关注,通过药监部门及研究机构十余年的努力,现有中药标准体系中外源性有害物检测技术及限量标准的更新是递进式逐步完善。中检院中药所在国家“十一五”“十二五”及“十三五”重大新药创制项目及国家药典会标准提高任务的支持下,通过近十年的努力在建立中药中外源性有害物检测平台的基础上,进一步对外源性污染物最大残留限量标准的修订以及风险评估体系的构建进行研究,并将其应用于中药中农药、重金属的风险评估工作]。同时基于风险评估数据,中检院中药所参与修订了《中国药典》2020年版四部“9302中药有害残留物限量制定指导原则”,结合中药使用特点(考虑中药服用频率和服用年限),提出了有害残留物最大限量的理论计算公式,见公式1。

       L=A×WM×SF×ATEF×ED×1t(公式1)

       式中L为最大限量理论值(mg/kg);A为每日允许摄入量(mg/kg bw);W为人体平均体重(kg),—般按63 kg计;M为中药材(饮片)每日人均可服用的最大剂量(kg);SF为安全因子,农药的安全因子规定为100;AT为平均寿命天数,一般为365天×70年;EF为中药材或饮片服用频率(每年多少天);ED为一生服用中药的暴露年限;t为中药材及饮片经煎煮或提取后农药的转移率(%);安全因子是指每日由中药材及其制品中摄取的农药残留量或重金属残留量所占日总暴露量(包括食物和饮用水)的比例。农药的安全因子规定为100,即表示由中药材及其制品中摄取的农药残留量不超过日总暴露量(包括食物和饮用水)的1%;重金属的安全因子为10。同时根据调研数据及国际权威毒理学研究数据,提出了中药中重金属及有害元素的一致性限度指导值,即规定药材及饮片(植物类)中铅不得过5 mg/kg,镉不得过1 mg/kg,砷不得过2 mg/kg,汞不得过0.2 mg/kg,铜不得过20 mg/kg。  

       然而大多数中药中的毒性成分以及毒性机制尚不清楚,故难以制定其毒性成分的限量值,导致药用安全存在一定隐患。近些年已有学者开展了中药中内源性有毒成分检测方法及限度值的研究,如刘静等建立天仙藤中5种马兜铃酸类成分的LC-MS/MS测定法;杨建波等采用HPLC法同时对何首乌中大黄素8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚、游离蒽醌和结合蒽醌的含量进行测定;昝珂等采用液质联用技术建立了中药中吡咯里西啶类生物碱的检测方法,并对25种常用中药材进行了吡咯里西啶类生物碱的筛查。由此可见,随着检测手段的发展,中药中毒性成分的检测技术已较为成熟,进一步如何对中药中的毒性成分进行合理评价,同时兼顾效益风险评价原则制定有毒中药科学、合理的限度值,是中药安全性监控所关注的重点问题。

       4 中药质控模式创新还应关注的发展方向

        综上所述,近十年来中药质量控制模式的瓶颈问题有了很大的突破,质控体系已经向更深层次、更科学合理的方向迈进,通过与现代前沿技术的结合逐渐解决了“丸散膏丹、神仙难辨”以及“有效成分说不清、道不明”的困境。然而中药的发展也是随着人类认知的进步不断向前的,随着新型技术的推进,建立符合中药特点的质控体系还要关注以下一些重点方向。

        4.1  拓展数字化在中药质控体系构建中的应用

        随着网络信息技术的飞速发展,数字化成了中药发展的必然趋势。相较于传统的中药鉴别方法,即评价方式多为模糊化、主观化的评判方法,构建的数字化体系更加具备客观性、规范性,可有效提高中药检验工作效率;且具有远程共享、智能识别等功能。目前已有学者开展了数字化标本馆、数字化标准物质(DRS)及数字化指纹图谱等的研究,并探索将其应用于中药质量评价。①数字标本馆是将各种原标本形态转化成数字信息进行存储,以计算机技术进入标本馆并提供服务,本地用户和远程用户可通过网络平台读取数字标本信息。中药数字标本馆的构建是其应用于质量控制的前提,近些年各研究部门积极开展了相应的工作,如康帅等应用体式荧光显微镜及数码成像技术对覆盆子聚合果及小核果的外观性状(正面观、侧面观、顶面观、基面观、表面构造)及内在构造(横剖面、纵剖面)进行观察和表征,并对此类信息进行数字化表达,为智能识别技术奠定基础。②DRS是实物标准物质的数字化、数据化、互联网化及智能化形式,以实物标准物质,应用于日常中药的定性和定量分析。DRS系统不仅存储了化合物的色谱行为,更存储了大量不同型号规格色谱柱的图谱信息,继而以这些信息为基础,建立适当的模型,供研究者对样品进行定性和定量分析。③数字化指纹图谱是利用数学原理或方法对指纹图谱本质特征进行定义、表达、重组、模拟等处理的过程,将检测方法和仪器检测的信号数据转化为容易鉴别且能揭示中药复杂信息特征的数字化信息。如邹纯才等以大黄为研究对象,利用特征峰的相对保留时间建立了其数字化指纹图谱。

        4.2  重视数据统计在中药指标成分识别中的应用

        数据统计分析是中药“谱效关系”研究、指标成分识别的重要手段,现有常用的数据分析技术包括:灰色关联度分析、主成分分析、聚类分析、人工神经网络等。一般情况下选择何种方法进行统计分析,主要根据实验目的及使用范围,其中主成分分析、聚类分析多用于判断化学成分对药效贡献的大小。如张华锋等采用聚类分析法研究了北柴胡保肝作用的谱效关系,最终得出保肝生化指标与柴胡皂苷a、柴胡皂苷d具有较高的相关性,认为基于保肝作用应以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d作为主要质控指标。灰色关联度分析法、人工神经网络等主要用于预测各成分与药效之间的关联度。如马雯芳等采用人工神经网络法研究滇桂艾纳香止血作用的谱效关系,找到与止血作用密切相关的色谱峰,继而通过人工神经网络 MATLAB 软件建立谱效关系模型,实现在质控过程中,输入指纹图谱信息即可对其止血作用进行质量评价。偏最小二乘回归分析法和多元线性回归法是阐明各化学成分对药效贡献率的分析方法。如徐硕等采用灰色关联度对罗布麻叶指纹图谱与其体外抗氧化活性的谱效关系进行研究,筛选出罗布麻叶抗氧化作用的活性物质主要为绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和山柰酚等成分。

        4.3  基于“真实世界”研究,建立符合临床药用特点的质控标准

        中药质量控制的终极目标是保证临床用药的安全有效,故在探索中药质量体系建立中应充分基于临床数据,这是进一步进行中药精准控制的重要举措。如肖小河课题组提出了评价指标与临床疗效关联程度的评控力原则,认为应以临床为导向构建中药质控体系,进而创建了中药质量整合评控力金字塔及中药优质性评价体系。鄢丹等基于临床生物特征谱学构建了中药质量评价体系,如利用等温滴定动态监测技术检测注射用益气复脉(冻干)的质量波动,此体系可与临床“真实世界”的中药疗效整体评价相关联。孙昱等亦提出基于疾病不同阶段的以中药功效为抓手的中药质量评价方法,分阶段进行“药性-功效成分-功效-作用机制”的药性与功效的关联性研究。

        4.4  重视传统药效部位成分的研究

        中药的传统服方式是水煎煮,煎煮后的药汤中多糖是其主要成分。中药多糖广泛存在于菌类、藻类、根茎类,以及果实种子类等药材中,并被确证具有较强的药理活性。同时中药多糖还是中药中的主要成分,如玉竹、黄精及铁皮石斛等药材中多糖含量达到6%以上。然而,目前构建的中药质控体系中的指标性成分多为小分子化合物,有关中药多糖质控体系的建立尚处于空白状态。现行《中国药典》标准中对于多糖的控制仅采用苯酚硫酸或蒽酮硫酸比色法控制其总量,此法的专属性和准确性均不佳,多糖质控技术的滞后已成为多糖类新药研发的瓶颈问题。随着近十年来研究人员对于中药多糖领域的不断关注,分别提出了糖谱和多糖多元指纹图谱的概念。此类方法运用传统分析技术,同时结合酶解法和数学统计法以达到对多糖结构分析目的。总的来说,中药多糖质控技术是整个中药质量评价的关键组成部分,亦是现有质控体系的薄弱环节,故发展中药中多糖类成分检测技术关乎中药质控体系的完整性。

        5 结  语

        国家中医药创新战略的重要性赋予了中药质量评价研究重大的契机;离子淌度质谱、质谱成像、二维色谱分离技术等现代前沿技术的蓬勃发展,中药分析领域学者高昂的研究热情,带给了中药质量评价关键问题突破新的希望。“传承精华,守正创新”的发展战略在中医药研究上尤为重要。新时代的中药研究者需继承中医药朴素的人文情怀与整体观哲学思维,同时要以开阔的视野吸纳现代科技的新思路、新技术,促进多学科融合,迎难而上突破关键技术,解决瓶颈问题,为提升中药产品质量,保证人民用药安全,实现中药产业的国际化发展奠定基础。

        (文章来源:《中国药学杂志》 作者:马双成、王莹、魏锋中国食品药品检定研究院)

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